O que é a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência?

A cromatografia tem como princípio básico a separação de determinadas misturas, utilizando dessa forma duas fases, uma móvel e outra estacionária. A fase móvel pode ser constituída por uma substância líquida ou um gás, já a fase estacionária é composta por um líquido ou um sólido.

O presente artigo irá descrever a cromatografia líquida de alta eficiência, um tipo de cromatografia pertencente a classificação colunar.

High Performance Liquid Cromatography (HPLC)

A cromatografia pode ser classificada como planar e colunar, existindo dessa forma vários tipos de cromatografia por exemplo, cromatografia gasosa, líquida, de camada delgada, etc.

A cromatografia líquida de alta eficiência – CLEA ou também conhecida com a sigla HPLC (High Performance Liquid Cromatography) faz parte do grupo de classificação da cromatografia colunar. Essa técnica cromatográfica normalmente é empregada em amostras de alimentos, água, solo, sangue, urina, etc.

Esse tipo de cromatografia obteve um avanço significativo a partir dos anos 70, e desde então vem apresentando novas sofisticações tecnológicas, dentre elas a utilização de colunas preenchidas por partículas de pequenos tamanhos, desenvolvimento e aperfeiçoamento de vários detectores por exemplo fluorescência, espectrofotômetros de massa acoplados ao HPLC, e dentre outros avanços que ocorreram desde a descoberta do equipamento.

Ela tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade.

Equipamento de HPLC

O equipamento para a realização desse tipo de cromatografia é denominado de cromatógrafo líquido que é constituído por vários sistemas, sendo eles:

• Sistema de reservatório de fase móvel;
• Sistema de bombeamento de fase móvel;
• Sistema de injeção;
• Sistema analítico que é constituído pela coluna cromatográfica;
• Sistema de detecção (existe detecção por UV, fluorescência, espectrofotometria de massas, etc.);
• Sistema de aquisição e registro de dados.

Fases da Cromatografia Líquida

Na cromatografia líquida existe um sistema composto por duas fases, uma fase móvel e outra fase denominada de estacionária.

Na fase estacionária podem ser utilizados compostos sólidos ou líquidos. Os sólidos normalmente são substâncias absorventes, tais como, sílica, carvão ativo, etc., que se encontram “empacotadas” em uma coluna, a qual é atravessada pela fase móvel. Nesse caso a base para a separação de misturas é chamada de absorção.

Já o composto líquido da fase estacionárias é denominado de película delgada, sendo que nesse caso a base de separação de misturas é denominado de partição.

Na fase móvel emprega-se uma mistura de alguns solventes, por exemplo, metanol, acetonitrila e água, sendo que essa mistura é denominada de Eluente. Normalmente para a fase móvel existem alguns critérios quanto aos solventes, tais como:

• O grau de pureza dos solventes,
• Baixa viscosidade;
• Dissolução da amostra sem perda dos compostos;
• Polaridade adequada para a realização da separação dos componentes da amostra.

Quanto a eluição de compostos é importante ressaltar que existem dois tipos de eluições:

• Isocrática: a composição da fase móvel (%B) se apresenta constante durante todo o processo de análise. Normalmente se utiliza um tipo de solvente.
• Gradiente: a composição da fase móvel (%B) pode ser alternada durante a realização da análise.

Nota: Em relação a porcentagem das eluições, essa denominação é definida de acordo com o tipo de bomba do cromatógrafo líquido, podendo ser uma bomba binária, quaternária, etc.

No caso da bomba binária, existem dois pistões e canais (estes denominados de canal A e canal B), os quais são responsáveis por todas as funções essenciais que fazem parte do sistema de fluxo dos solventes.

Portanto, quando se diz %B, estará indicando a porcentagem de solvente que irá passar pelo canal B.

Aquisição de dados e resultados

Para a cromatografia normalmente se utiliza sistemas de computação ou automação. Esses sistemas têm o intuito de aumentar a capacidade de utilização dos aparelhos, por meio de injeção de amostra, inserção de dados das amostras e métodos, aquisição e tratamento de dados.

A aquisição e tratamento de dados irá definir a precisão de um pico gerado no cromatograma, além de permitir a determinação de tempos e intensidades (áreas e alturas dos picos), lembrando que normalmente os gráficos gerados apresentam uma relação de tempo e sinal do detector para os analitos como pode ser verificado abaixo:

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrofotometria de Massa

Com o desenvolvimento das tecnologias a cromatografia pode ser relacionada com diferentes sistemas de detecção, sendo um deles a espectrofotometria de massas. Essa junção garante alta sensibilidade e eficiência na separação das fases, além de obter informações referentes aos compostos analisados, por exemplo, a massa molar, estrutura química, seletividade, dentre outros.

De acordo com a IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), a espectrofotometria de massas pode ser definida como a análise da matéria através da formação de íons em fase gasosa e consequentemente caracterizados de acordo com sua massa, carga, estrutura e propriedades físico-químicas.

Em suma, a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrofotometria de massas pode ser utilizada em aplicações forenses, ambientais, substâncias químicas, farmacêuticas, alimentícias e dentre outras áreas.

Artigo desenvolvido por: Laila Cristina Grubert